雜合二倍體的形成和檢出
(1)雜合二倍體的形成和誘發(fā)雜合二倍體是由兩個不同遺傳型的單倍細胞核融合產生的。雜合二倍體就在異核體菌落表面上形成與異核體菌落顏色不同的角變(扇形)或斑點分生孢子。挑取角變或斑點上的孢子，進行分離純化，可以得到純雜合二倍體的菌株。異核體自發(fā)核融合而形成雜合二倍體的頻率極低，常以人工誘發(fā)方法來提高頻率。采用天然樟腦蒸氣熏蒸或紫外線處理異核體的菌絲或者分生孢子，然后再繼續(xù)培養(yǎng)是常用的方法。
(2)雜合二倍體的檢出 雜合二倍體常常在異核體菌落上以角變或斑點形態(tài)出現，這種角變或斑點往往是野生型親本的孢子顏色或菌落結構而區(qū)別于異核體。用接種針挑取它們上面的分生孢子，再用自然分離的方法進行分離、純化，即可獲得雜合二倍體。還可以將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化．即得雜合雙倍體。由于雜合二倍體是霉菌準性生殖過程中的重要組成部分，也是雜交育種的關鍵性一步。因此，獲得的純雜合二倍體菌株除了需要多次的分離、純化外，還要對它的形態(tài)、生理和遺傳等特性進行研究，以確保不混雜其他菌株。
1.體細胞重組
體細胞重組包括體細胞交換、體細胞分離和單倍化三個階段。
(1)體細胞交換體細胞交換是指雜合二倍體在有絲分裂過程中發(fā)生染色體交換現象．當雜臺二倍體細胞在繁殖過程中進行有絲分裂，同源染色體的兩條單體間一些位點會發(fā)生三換，結果導致同源染色體上部分區(qū)段出現重組．產生新的二倍體子代。
(2)體細胞分離雜合二倍體在有絲分裂過程中，細胞核內的同源染色體以偶然的機會發(fā)生交換，而引起局部染色體上基因種類發(fā)生變化，從而產生基因型不同的后代，稱為體量胞分離，其結果是產生多種類型的分離子。
(3)單倍化單倍化是指雜合二倍體細胞在增殖過程中借助整條染色體的隨機交換而得到單倍重組體或單倍的親本分離子。單倍化過程發(fā)生在體細胞有絲分裂時期，細胞分裂時遺傳物質分配不均，除了產生正常的二倍體細胞外，還會產生非整倍體細胞，這種細胞一般不穩(wěn)定，再經過多次細胞分裂后，失去一些染色體而變成單倍體細胞，形成多種類型的單倍體分離子。由于這個過程不存在顯性基因，使得在分離子中顯現出隱性性狀。
(4)分離子 雜合二倍體經過體細胞交換和單倍化后產生的子細胞，稱為分離子。分離子種類很多，根據不同情況可以分為以下幾類：親本分離子、原養(yǎng)型分離子和異養(yǎng)型分離子；二倍分離子、單倍分離子和非整倍分離子；初級分離子和次級分離子。親本型分離子的表現型和基因型與直接親本相同。原養(yǎng)型分離子不缺少直接親本所缺陷的性狀，基因型一般與野生型菌株類似。異養(yǎng)型分離子表現出直接親本所不具有的新的性狀，但仍具有直接親本的部分缺陷性狀。由雜合二倍體繁殖后*次產生的子細胞，稱為初級分離子，如果初級分離子或非整倍分離子再移接一代后產生的分離子，稱為次級分離子。
(5)分離子的檢出與測定方法盡管雜合二倍體用誘變劑或重組劑誘發(fā)，可以提高分離子產生的頻率，但總的來說，產生的分離子數量仍然很少。要想在大量的菌落中識別和檢出各種分離子，主要根據分離子攜帶的隱性標記。
檢出分離子常用的方法是將雜合二倍體菌落產生的分生孢子分離在*培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后在長出的大量菌落中找到個別菌落上出現具有隱性標記突變顏色的角變或斑點，挑取它們上面的分生孢子移接到*培養(yǎng)基斜面，進一步分離、純化。如果要檢出抗性分離子，可將雜合二倍體孢子分離在選擇性培養(yǎng)基平板上，則可篩選出耐藥性分離子。選擇性培養(yǎng)基有兩種：一種是含有重組劑的*培養(yǎng)基，如對氟(PFA)不會引起基因突變，但能促進體細胞重組，增加分離子的出現頻率；另一種是在*培養(yǎng)基中加入吖啶黃之類的藥物，因為一個抗性菌株和一個敏感菌株形成的雙倍體對吖啶黃是敏感的．在這種培養(yǎng)基上不能生長，只有耐藥性分離子可以生長。
從雜合二倍體中檢出的分離子，必須進行分離純化，然而對它們的特性進行全面測定分析，包括菌落形態(tài)、營養(yǎng)要求、孢子顏色、孢子DNA含量以及代謝產物能力等。
2.高產重組體的篩選
雜交育種的目的是獲得高產、穩(wěn)定的重組體。異核體和雜合二倍體在遺傳上是不穩(wěn)定的，在繁殖過程中會發(fā)生分離現象，導致產量下降。只有單倍重組體才是穩(wěn)定的。在進行霉菌雜交育種時要注意以下幾點：選擇的兩個親本菌株，不僅要具有不同的優(yōu)良性狀．而且是近親配對組合，這樣易獲得產量高的重組體；要用合適的誘變劑處理雜合二倍體，促使它進行體細胞交換和單倍化過程，選出具有高產和優(yōu)良性狀的單倍重組體；對獲得的重組體進行特性代謝調節(jié)，即篩選適應酶系統(tǒng)調節(jié)突變株，使高產重組體能夠充分發(fā)揮其高產潛力并能適應工業(yè)化。
上一篇 ELISA樣本分析 下一篇 標本采集的基本要求
