吖啶橙染色液的制備
吖啶橙(acridine orange，AO)是一種常用熒光染料，吖啶橙與原代細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力，但有一定的特異性，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡(jiǎn)便快捷，既可染活原代細(xì)胞又可染固定原代細(xì)胞。用于直凄染色觀察活原代細(xì)胞或固定染色觀察原代細(xì)胞均可。吖啶橙對(duì)活原代細(xì)胞毒性小，可用于直接染色活原代細(xì)胞和進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，但不持久，用固定染色觀察法效果更好。
(一)吖啶橙染色液的制備
取1g吖啶橙，溶于100ml生理鹽水中，配成1％的母液，4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，用0．1mol／L PBS(pH4．8)稀釋成O．01％的工作液。
(二)染色步驟以蓋玻片培養(yǎng)法為例
1．標(biāo)本用Hanks脫洗3次。
2．用95％乙醇溶液固定15～30min，取出后晾干。
3．用l％醋酸作用30s。
4．用PBS沖洗1min。
5．移入0．1mol／L吖啶橙顯色液中染色1～5min，分色30s～2min。
6．用PBS沖洗lmin。細(xì)胞
7．移入O．1mol／L CaCl2中分色30s～2min。
8．用PBS沖洗1min。
9．用甘油一PBS(1：1)封片，立即觀察(用激發(fā)波長(zhǎng)405nm的濾光片)。
(三)結(jié)果
細(xì)胞核內(nèi)因含DNA而呈亮綠色，胞質(zhì)及核仁因含RNA而呈橘紅色或火紅色。
(四)注意事項(xiàng)
觀察中應(yīng)隨時(shí)添加PBS以避免標(biāo)本干涸，如用油浸鏡觀察，需再覆蓋以大蓋玻片蓋在附有細(xì)胞蓋玻片上(細(xì)胞面朝上)，用無熒光性油浸觀察。標(biāo)本在95％乙醇中能保存數(shù)日后仍能觀察，如褪色，再用吖啶橙染色。
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